Para mí fue un gran honor haber participado del programa Biominds ya que me permitió la oportunidad de trabajar en un laboratorio de investigación a nivel graduado y a su vea poder aportar información valiosa a la comunidad científica. Este mismo entusiasmo pude percibir en los trabajos de los compañeros que me toco evaluar en el “Biominds Research Day”. A continuación voy a explicar brevemente los trabajos de investigación de los estudiantes:

Ana Velázquez

El titulo de su investigación es: Recombinant expression of glycosyl hydrolase Genes from hyperthermophiles Isolated from Puerto Rico and their possible role in Biotechnology. Dentro de su investigación esta estudiante estuvo confrontando muchos problemas para cultivar los organismos que expresaban este gen. Esta aprendió nuevas técnicas de laboratorio, pero a la vez pudo comprender que para poder tener resultados significativos en una investigación se necesita de mucha paciencia y compromiso, la cual la ayudo poder tener resultados en su investigación luego de un año de trabajo. Para mí esto es más importante que cualquier resultado positivo dentro de una investigación. El fin de esta investigación es poder expresar este gen en la yuca para que la misma pueda fermentar más almidón.

Isabelita Martínez

El titulo de su investigación es: Isolation of important clinic yeasts in water treatment plants and Puerto Rico forest. Los resultados de esta investigación son muy relevantes para la comunidad científica, ya que nos muestra cuales levaduras clínicas, estamos más expuestos los humanos. Ya que estas al igual que las bacterias causan enfermedades mortales a las personas. El fin de esta investigación es poder determinar cuáles levaduras clínicas están presente en las aguas costeras de Puerto Rico y su impacto a la sociedad. Algunos de los factores que quieren evaluar, es si estas levaduras poseen resistencia a antibióticos y que mecanismo la célula está utilizando para expresar estos genes. En adición están muestreando bosques y plantas de tratamientos, que son dos ambientes opuestos (uno con poco impacto humano y otro con gran impacto de humano), como grupo control para poder evaluar los resultados obtenidos.

Víctor Irizarry

El titulo de su investigación es: Radiation Resistant Geo-Microbes (RR Gems) in Soils of Puerto Rico. Esta investigación es bien innovadora, ya que busca microorganismos que sean resistentes a los rayos ultravioleta (UV). En especial los rayos UV (C) que no son capaces de traspasar la capa de ozono y que actúa directamente en el DNA de los organismos. Los resultados de esta investigación ayudarían a entender el impacto de estos rayos al ambiente, por el efecto del rompimiento de la capa de ozono. En adición poder especular que organismo están presentes en otros planetas que tienen mayor contacto con estos rayos, como lo es Marte. Algo muy peculiar de esta investigación es que solo bacterias gran (+) son resistentes a estos rayos y pueden desarrollarse como una bacteria normal.

Durante mi primer mes de investigación he tenido un progreso intermedio en la misma. En el análisis de las secuencias parciales del gen cassette, conseguí un nuevo gen que esta codificado en el integron clase 1 de la bacteria Klebsiella. Este es un aminoglycoside adenyltransferase. Algunas de las dificultades que he encontrado en mi investigación es la optimización del gel del producto del box pcr, ya que dependo de la misma para identificar si el genoma de mis sepas son las mismas o diferentes, y luego compararla con la identificación de los genes cassette encontrados. Algunas de las modificaciones que he tenidos que realizar para esta técnica es cambiar la agarosa y la concentración que utilizaba para obtener mejor separación de mis bandas. Correr el gel en diferentes cámaras de electroforesis para observar en cual obtengo mejor imagen. También utilice varios power supply a diferentes voltajes y tiempo de exposición para eliminar los errores técnicos de estas técnicas.

Prevalence of Clinical Integrons and Potential, Integron-Encoded

Extanded Spectrum Beta-Lactamases Among Clinical Strains

of Klebsiella pneomoniae from Puerto Rico

Glendalis Vargas¹, Carlos M. Rodríguez Minguela¹, Joselyn M. Rodríguez Vega¹,

Doris Vera², Sonia Saavedra²,

¹Department of Biology, University of Puerto Rico, Mayagüez, PR,
²Veteran Affairs Hospital, Río Piedras, PR

The integron platform is a gene capture module which is being increasingly documented as a key element that facilitates the dispersal of extended spectrum β-lactamases (ESBLs) a group of enzymes that catalyze the chemical inactivation of the most widely used antibiotics, the β-lactam drugs. In this project we applied PCR-based methods to evaluate if ESBL-mediated resistance in a collection of 15 clinical strains of Klebsiella pneumoniae was integron-encoded and to determine whether specific strain genotypes show any pattern in respect to the presence of a particular integron class or integron-encoded antibiotic resistance determinant. Based on BOX-PCR genomic fingerprinting we have identified six different genotypes among the tested strains. All strains were positive for the presence of class 1 integrons while class 2 and class 3 integrons were not detected. The detected class 1 integrons appeared to be diverse in terms of their gene cassette content as amplification products using a cassette-targeted PCR assay ranged from 1.2 to 2.5kb. Five of the isolates show the presence of gene cassettes ranging from 2.4-2.5Kb while three cultures presented cassettes ranging from 1.2-1.5Kb. A single culture show one cassette of 1.2kb whereas only one strain produced two gene cassettes of 1.8-2.5kb suggesting the presence of two class 1 integrons in the same strain. However 5 strains did not yield a PCR product after several attempts of gene cassette amplification were preformed, suggesting the presence of unloaded integrons or class 1 integrons variants lacking at least a conserved priming site. Moreover, integron gene cassette content appeared to be related to specific bacterial genotypes as amplified gene cassettes of a particular size were associated with certain clonal lineages. The sequencing analysis of gene cassettes is currently under progress to determine if ESBL resistance is conferred by integrons. So far we have identified partial sequences of a dehydrofolate reductase, aminoglycoside adenyltransferase and an efflux pump which are implicated in conferring resistance against trimethoprim and quaternary ammonium compounds respectively. We plan to extend this analysis to a larger set of strains to gain a comprehensive vision of dispersal trends of integron-encoded resistance determinants at the local clinical scenario.

Durante este semestre estaré optimizando el protocolo de Box pcr para poder comparar los resultados que obtenga con los análisis filogenéticos de las secuencias de los genes casssette, con los de la gel del box pcr. Esto me ayudara a hacer mejor análisis de los resultados que obtenga en mi investigación. También estaré construyendo arboles filogenéticos de las secuencias parciales de los genes cassette para analizar la relación evolutiva de estos en comparación con otras bacterias que poseen el mismo fragmento de DNA. Esto me ayuda a identificar qué tipo de genes de resistencia a antibióticos están codificados en los genes cassette de esta bacteria y compararlas con el listado de antibióticos que estas son resistentes según las pruebas realizadas previamente. También durante este semestre estaré analizando el patrón de bases de las diferentes sepas de Klebsiella presente en la gel del box pcr y agruparlas según su semejanza. Esta información la comparare con el origen de estas sepas, de que paciente fue obtenida y que condición padecía. Esta data me ayuda a comprender que personas son más propensas a contraer infecciones mediadas por bacterias resistencia a antibióticos y cuales enfermedades son mediadas por bacterias resistentes a antibióticos.

El trabajo que estaré realizando durante este semestre es una continuación del los trabajos realizados durante los semestres anteriores. En especial estaré optimizando algunas de las técnicas que utilizo en especial el box PCR, ya que este trabajo de investigación lo estaré utilizando para mi maestría, la cual comenzare en agosto. En especial estaré analizando y construyendo arboles filogenéticos de cada una de las secuencias parciales de los genes cassette que aislé de las cepas de las Klebsiellas que estudio.

Durante este semestre estaré utilizando el programa “gel compare” para analizar las geles de los box PRC de cepas de Klebsiella en este podre hacer un estimado de la cantidad de pares de bases que posee cada una de las bandas presentes en la gel.

Durante este semestre académico he obtenido muchos resultados muy interesantes. Actualmente termine de analizar 15 sepas de la bacteria Klebsiella pneumonia, donde encontré que todas codifican para integrones clínicos en su genoma. Solo 10 de las mismas tienen presencia de genes cassettes insertados en los integrones y 5 de estas poseen integrones vacios. Dentro de los integrones de estas bacterias encontramos una amplia diversidad de genes cassette. Entre las mismas encontramos 5 diferentes genes cassette y sus amplicones varían entre 1.2 a 2.5 kb. En adición encontramos una de estas sepas contenía dos genes cassette presentes en el integron. Actualmente tenemos todos los amplicones de los cassette en plasmidos. A uno de los genes cassette se envió a secuenciar y tenemos la secuencia de pares de bases presentes en el mismo. En este encontramos la presencia de los genes de resistencia a qac efflux pump y dehydrofolate reductase. Los que nosotros esperábamos encontrar era la presencia de genes de resistencia a B-Lactamasas. Pero la secuencia de pares de bases que nos enviaron es parcial ya que no secuenciaron el gen cassette completo, solo nos enviaron la información de las primeras pares de bases en ambas direcciones y con esta información no podemos determinar con exactitud cuales genes poseen estos genes cassette. En estos momentos estamos esperando las secuencias de los 4 genes cassette que enviamos a secuenciar, para analizarlos. Nuestras proyecciones para el semestre que viene es enviar a secuenciar completamente los genes cassette para determinar qué genes están codificados en estos. Otras de nuestras expectativas son analizar otras bacterias resistentes a antibióticos como lo son E. coli y Pseudomonas para verificar si las mismas tienen presencia de integrones clínicos.

Durante el mes de noviembre tuve la oportunidad de presentar mi trabajo investigativo en la conferencia anual de minoría ABRCMS. La misma contaba de diversas conferencias donde te mostraban todas los pasos a seguir para entrar a una escuela graduada, también nos ofrecieron conferencias de investigación resientes de alta importancia en la comunidad científica. En la misma se estuvieron presentando alrededor de 2,000 estudiantes los cuales tenían la oportunidad de presentar oralmente o en poster sus trabajos investigativos. Para mí fue una experiencia enriquecedora ya que te daba la oportunidad de presentar tu trabajo investigativo, donde enseñabas a los demás tu contribución a la ciencia. También tuvimos la oportunidad de visitar diferentes mesas informativas de más de 100 universidades alrededor de los Estados Unidos y América, donde te ofrecían información de los programas graduados y de investigación que estos poseen. Lo mejor de toda la conferencia fue que 16 estudiantes de Puerto Rico obtuvieron premios y de estos 8 se vinieron para el colegio. Como estudiante de la Universidad de Puerto Rico es un gran honor para mí, que mis compañeros hayan obtenidos esos premios, ya que estos demuestra el nivel de responsabilidad y el potencial que tenemos los estudiantes de PR con la ciencia.

Durante el mes de octubre obtuve un sobresaliente progreso en mi investigación, ya que logre uno de los objetivos principales de la misma que era secuenciar la secuencia de los cassette de los integrones presentes en la bacteria K. pneumoniae. Las mismas fueron analizadas y con la información obtenida de las proteínas que se codifica cada secuencia de aminoácidos creamos un árbol filogenético done se muestra la relación evolutiva entre mi proteína en comparación con proteínas semejantes que poseen otras bacterias. Al crear nuestro árbol encontramos que nuestra secuencia se transcribe a una proteína presente en bacterias resistentes a antibióticos y es muy similar a unas que se encuentran en bacterias ambientales. Esto nos indica que estas secuencias de DNA se están pasando de forma horizontal en el ambiente. Esto puede afectar negativamente a la comunidad médica, ya que estas secuencias se encuentra presentes en el ambiente y bacterias que no son resistentes a antibióticos se pueden cargar con estos genes y tornarse resistentes. Esto lo estamos viendo hoy día en los hospitales de Puerto Rico, ya que en los pasados meses se ha presentado dos brotes de la bacteria Klebsiella pneumoniae (la cual la estoy estudiando) causando la muerte de varias personas. Esta bacteria en particular es multi-resistente ya que en su genoma tiene los genes para sobrevivir en presencia de varios antibióticos. Esta incorporo estos genes adquiriéndolos del ambiente y del mal manejo de los antibióticos entre las personas. Mi trabajo actualmente consiste en analizar si estas bacterias están cargadas con integrones, los cuales son segmentos de DNA que codifican para la resistencia a antibióticos. Actualmente estoy trabajando con 15 sepas del Hospital de Veterano de San Juan, las cuales ya identifique que tienen presencia de integrones clase I. En estos momentos estoy analizando los cassette con los cuales están cargados estos integrones, para analizar la secuencia de nucleótidos de cada uno y de esta forma identificar las proteínas que codifican estos. Con esta información poder comparar mi proteína con la bases de datos, para verificar la semejanza con otras proteínas.

La técnica que actualmente estoy utilizando es mi investigación es el análisis de secuencia de DNA utilizando Bioinformatica. Esta es una muy innovadora ya que nos permite entender el comportamiento de los organismos más a fondo, desde la estructura del genoma, ya que los mismos no se pueden determinar todos a través de pruebas bioquímicas y el crecimiento en plato de los organismos. A través de esta técnica voy a estar analizando la secuencia de DNA de integrones clase 1 presentes en la bacteria Klebsiella, para identificar secuencias que codifiquen para proteínas dentro de este fragmento e identificar que otras bacterias poseen esa la secuencia de DNA para producir esta proteína. Entre mayor cantidad de bacterias posean ese fragmento nos indica que estos genes se están pasando por transferencia horizontal. También podemos conocer los “open reading frame” que son segmentos donde nos indican que hay un marca abierto de lectura donde comienza el segmento para producir una nueva proteína.

Hasta el momento el progreso en mi investigación es intermedio, ya que actualmente he logrado realizar la mitad de las metas que me propuse para este semestre. Ya que la carga académica que poseo actualmente no me ha permitido trabajar tiempo completo en el laboratorio.

La dificultad más grande que he enfrentado durante este semestre es que algunas de la cepas de las bacterias Klebsiella no me amplificado al momento de realizar el box pcr y esto me ha atrasado un poco en mis resultados, ya que dependo de los mismos para analizar y comprobar los datos que obtenga de la secuenciación del DNA.

Durante el verano 2008 estuve 10 semanas en el programa Massachusetts Sumer Research Program (MSRP) Biology en MIT. En el cual estuve trabajando con la bacteria Helicobacter pylori, la cual es microaerofilica ya que puede sobrevivir a baja concentraciones de oxigeno. Esta tiene la capacidad de sobrevivir por décadas dentro del estomago humano, y a que produce muchas enzimas para neutralizar los químicos que liberan las células inmunológicas para destruir a la bacteria. Mi investigación era tratar de identificar cual dosis y tiempo de exposición sobrevive más de 50% esta bacteria en presencia de peróxido de hidrogeno. Luego le extraía el RNA para convertirlo en cDNA y hibridizarlo en una placa de microarrays que tenía secuencias conocidas de DNA de Helicobacter pylori. La finalidad de esta investigación era conocer cuales genes expresa esta bacteria en presencia de una ambiente oxidativo y de esta forma conocer si los mecanismos de sobrevivencia están codificados a un gen en especifico.

Dentro de mi investigación tengo varios proyectos para este semestre. Mi principal trabajo es analizar las secuencias de DNA de los integrones encontradas en las Klebsiella, para poder identificar si los integrones que cargan son conocidos o son nuevas generaciones. También poder identificar si estas bacterias poseen más de un integron. Nuestro mayor proyecto es conseguir primers que amplifiquen los cassette que cargados en cada integron, en especial para los integrones clase 2. Con esto se puede identificar qué cantidad de cassette carga cada integron. Luego de encontrar todos estos datos tenemos que repetir cada experimento para corroborar la información. También vamos a comenzar a analizar unas sepas de E. coli and P. aeruginosa que son resistentes a antibióticos, para verificar si están cargados con integrones. El trabajo que estaremos realizando este semestre es la continuación a los hallazgos encontrados el semestre anterior. Dentro del laboratorio seguiremos utilizando las mismas técnicas moleculares anteriores (PCR, electroforesis, extracción de plasmido y DNA). La única técnica que estaremos implementando es la Bioinformatica para analizar los resultados obtenidos en la secuenciación del DNA.

Todas las técnicas que utilizo en mi laboratorio me han ayudado a obtener más conocimientos me han ayudado a tener un mejor desempeño en mi investigación. Algunas de las técnicas que estoy utilizando en el laboratorio de investigación es la extracción de DNA, de plasmidos, preparación de plasmidos para secuenciar, purificación de plasmidos y la utilización de primers de integrones para identificar presencia de integrones en muestras clínicas. Adicional a las técnicas moleculares que normalmente utilizo como el PCR y la electroforesis. Estas técnicas se realizan en secuencia ya que la finalidad de las mismas es poder enviar las muestras a secuenciar, para conocer su secuencia de genes. De esta forma poder comprobar mis resultados, con los de mi compañera y de esta forma buscar semejanzas en nuestras investigaciones. Estas dos técnicas, conjunto con las técnicas moleculares son muy cruciales en la obtención de información en mi investigación, ya que me permiten obtener el DNA de mis muestras purificadas y listas para comenzar con mi trabajo. Estas técnicas me permiten conocer la información genética de muchas bacterias que no se conocen actualmente, ya que solo el 1% de las bacterias del mundo son conocidas.

    Mi experiencia al entrar a los blogs de mis compañeros fue muy enriquecedora, ya que me permitió conocer distintas investigaciones muy interesantes que realizan en la Universidad.  También pude  comprobar que utilizamos muchas técnicas en común en nuestras investigaciones. Adicional muchas de las investigaciones tienen relación unas con las otras, con esto comprobamos que la ciencia es interdisciplinaria y envuelve muchas materias.