Durante el mes de octubre obtuve un sobresaliente progreso en mi investigación, ya que logre uno de los objetivos principales de la misma que era secuenciar la secuencia de los cassette de los integrones presentes en la bacteria K. pneumoniae. Las mismas fueron analizadas y con la información obtenida de las proteínas que se codifica cada secuencia de aminoácidos creamos un árbol filogenético done se muestra la relación evolutiva entre mi proteína en comparación con proteínas semejantes que poseen otras bacterias. Al crear nuestro árbol encontramos que nuestra secuencia se transcribe a una proteína presente en bacterias resistentes a antibióticos y es muy similar a unas que se encuentran en bacterias ambientales. Esto nos indica que estas secuencias de DNA se están pasando de forma horizontal en el ambiente. Esto puede afectar negativamente a la comunidad médica, ya que estas secuencias se encuentra presentes en el ambiente y bacterias que no son resistentes a antibióticos se pueden cargar con estos genes y tornarse resistentes. Esto lo estamos viendo hoy día en los hospitales de Puerto Rico, ya que en los pasados meses se ha presentado dos brotes de la bacteria Klebsiella pneumoniae (la cual la estoy estudiando) causando la muerte de varias personas. Esta bacteria en particular es multi-resistente ya que en su genoma tiene los genes para sobrevivir en presencia de varios antibióticos. Esta incorporo estos genes adquiriéndolos del ambiente y del mal manejo de los antibióticos entre las personas. Mi trabajo actualmente consiste en analizar si estas bacterias están cargadas con integrones, los cuales son segmentos de DNA que codifican para la resistencia a antibióticos. Actualmente estoy trabajando con 15 sepas del Hospital de Veterano de San Juan, las cuales ya identifique que tienen presencia de integrones clase I. En estos momentos estoy analizando los cassette con los cuales están cargados estos integrones, para analizar la secuencia de nucleótidos de cada uno y de esta forma identificar las proteínas que codifican estos. Con esta información poder comparar mi proteína con la bases de datos, para verificar la semejanza con otras proteínas.
Técnicas utilizadas en el laboratorio September 25, 2008
La técnica que actualmente estoy utilizando es mi investigación es el análisis de secuencia de DNA utilizando Bioinformatica. Esta es una muy innovadora ya que nos permite entender el comportamiento de los organismos más a fondo, desde la estructura del genoma, ya que los mismos no se pueden determinar todos a través de pruebas bioquímicas y el crecimiento en plato de los organismos. A través de esta técnica voy a estar analizando la secuencia de DNA de integrones clase 1 presentes en la bacteria Klebsiella, para identificar secuencias que codifiquen para proteínas dentro de este fragmento e identificar que otras bacterias poseen esa la secuencia de DNA para producir esta proteína. Entre mayor cantidad de bacterias posean ese fragmento nos indica que estos genes se están pasando por transferencia horizontal. También podemos conocer los “open reading frame” que son segmentos donde nos indican que hay un marca abierto de lectura donde comienza el segmento para producir una nueva proteína.
Hasta el momento el progreso en mi investigación es intermedio, ya que actualmente he logrado realizar la mitad de las metas que me propuse para este semestre. Ya que la carga académica que poseo actualmente no me ha permitido trabajar tiempo completo en el laboratorio.
La dificultad más grande que he enfrentado durante este semestre es que algunas de la cepas de las bacterias Klebsiella no me amplificado al momento de realizar el box pcr y esto me ha atrasado un poco en mis resultados, ya que dependo de los mismos para analizar y comprobar los datos que obtenga de la secuenciación del DNA.
Mis experiencias y expectativas para este semestre August 25, 2008
Durante el verano 2008 estuve 10 semanas en el programa Massachusetts Sumer Research Program (MSRP) Biology en MIT. En el cual estuve trabajando con la bacteria Helicobacter pylori, la cual es microaerofilica ya que puede sobrevivir a baja concentraciones de oxigeno. Esta tiene la capacidad de sobrevivir por décadas dentro del estomago humano, y a que produce muchas enzimas para neutralizar los químicos que liberan las células inmunológicas para destruir a la bacteria. Mi investigación era tratar de identificar cual dosis y tiempo de exposición sobrevive más de 50% esta bacteria en presencia de peróxido de hidrogeno. Luego le extraía el RNA para convertirlo en cDNA y hibridizarlo en una placa de microarrays que tenía secuencias conocidas de DNA de Helicobacter pylori. La finalidad de esta investigación era conocer cuales genes expresa esta bacteria en presencia de una ambiente oxidativo y de esta forma conocer si los mecanismos de sobrevivencia están codificados a un gen en especifico.
Dentro de mi investigación tengo varios proyectos para este semestre. Mi principal trabajo es analizar las secuencias de DNA de los integrones encontradas en las Klebsiella, para poder identificar si los integrones que cargan son conocidos o son nuevas generaciones. También poder identificar si estas bacterias poseen más de un integron. Nuestro mayor proyecto es conseguir primers que amplifiquen los cassette que cargados en cada integron, en especial para los integrones clase 2. Con esto se puede identificar qué cantidad de cassette carga cada integron. Luego de encontrar todos estos datos tenemos que repetir cada experimento para corroborar la información. También vamos a comenzar a analizar unas sepas de E. coli and P. aeruginosa que son resistentes a antibióticos, para verificar si están cargados con integrones. El trabajo que estaremos realizando este semestre es la continuación a los hallazgos encontrados el semestre anterior. Dentro del laboratorio seguiremos utilizando las mismas técnicas moleculares anteriores (PCR, electroforesis, extracción de plasmido y DNA). La única técnica que estaremos implementando es la Bioinformatica para analizar los resultados obtenidos en la secuenciación del DNA.
Algunas de mis experiencias en el laboratorio April 24, 2008
Experiencias de trabajar en equipo February 25, 2008
Llevo dos meses trabajando en conjunto con el Dr. Carlos Rodríguez y la estudiante sub-graduada Paloma Monroig, en el laboratorio de investigación. Ambas actualmente estamos trabajando en conjunto con plasmidos extraídos de las muestras de agua de la planta de tratamiento de Mayagüez. La comunicación entre ambas es efectiva ya que al momento de tener una duda la consultamos y nos ayudamos mutuamente para realizar nuestro trabajo. Tener una comunicación efectiva dentro de un laboratorio es muy provecho, ya que ambas realizamos trabajos similares y al momento de una no poder terminar un trabajo, la otra colabora para culminarlo. Algunas de las ideas que hemos implementado para tener mejores resultados en las experimentaciones e involucra el trabajo en equipo es que cuando realizamos una corrección en alguno de los protocolos, se lo informamos a nuestra compañera, para que al momento de esta realizar lo haga correctamente. Otra de las técnicas que hemos implementado es anotar todas las tareas que realizamos por día en la libreta del laboratorio, por si nuestra compañera tiene una duda las puede consultar al momento de no estar en el laboratorio. También es muy importante tener una constante comunicación con tu mentor, ya que él es quien te dirige en la investigación y esto contribuye a que se obtengan resultados relevantes. Día a día se consultan los resultados obtenidos con el profesor, para que este los verifique y de su aprobación haber si están correctos, de no estarlos se realiza el procedimiento nuevamente. Algunas de los obstáculos mayores que hemos presentado en el laboratorio es que ambas somos muy perfeccionistas y en algunos momentos no aceptamos sugerencias de otras personas, pero esas son dificultades normales de trabajar en equipo.
Papel de los integrones en la resistencia a los agentes antimicrobianos February 25, 2008
María Teresa Coque-Gonzáleza
aInvestigador del Sistema Nacional de Salud (SNS). Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Ramón y Cajal. IMSALUD. Madrid. España.
Enferm Infecc Microbiol Clin 2005; 23: 251 – 253
Los integrones son sistemas de recombinación específicos de sitio responsables del reconocimiento, captura y expresión de casetes (elementos móviles constituidos por un gen carente de promotor y un lugar de recombinación específico conocido como elemento 59 bp). De forma general, estos elementos se han dividido operativamente en integrones de resistencia (IR) y superintegrones (SI). Los IR se encuentran habitualmente formando parte de transposones y/o plásmidos y contienen mayoritariamente genes de resistencia a antibióticos, mientras que los SI se localizan en el cromosoma de ciertas especies bacterianas y contienen genes asociados a múltiples funciones adaptativas. Otras diferencias son el número y orientación de los casetes que contienen y la diversidad y tamaño de los elementos de 59 bp. Hasta el momento se han descrito cinco clases de IR. Los integrones de clase 1 son los más frecuentes, seguidos de los integrones de clase 2; respectivamente asociados a transposones de la familia de Tn 3 y Tn 7. Los integrones de clase 3 son similares a los de clase 1 y se han descrito de forma esporádica. Estos tres tipos de integrones se han detectado mayoritariamente en enterobacterias, Pseudomonas y Acinetobacter , aunque también se han encontrado elementos de clase 1 en algunos microorganismos grampositivos. En la actualidad, los IR se consideran los principales responsables de la acumulación y diseminación recientes de casetes de resistencia en el genoma bacteriano, habiendo despertado un gran interés por su implicación en la resistencia a nuevos antibióticos como cefalosporinas de amplio espectro, carbapenémicos y quinolonas. También se han relacionado con la selección y dispersión epidémica de clones de determinadas especies bacterianas (Salmonella enterica, V. cholerae) . Es particularmente atractiva la capacidad de los IR para generar estructuras formadas por la asociación de diversos elementos genéticos de resistencia y/o virulencia. La presencia de IR en plásmidos conjugativos y/o transposones diseminados mundialmente y descritos con anterioridad a la era antibiótica podría explicar su rápida dispersión en las últimas décadas. De hecho, la baja diversidad y gran estabilidad temporal de la estructura de los integrones de clase 1 y 2 en aislados clínicos resistentes a antibióticos de las últimas dos décadas apoyaría la hipótesis de episodios de selección de un pequeño número de unidades de captura génica ocurrida en el medio hospitalario como consecuencia del uso de antibióticos.
Proyecto de Investigación February 11, 2008
Mi trabajo investigativo lo realizo analizando los integrones de bacterias resistentes a antibióticos presentes en hospitales, para compararlas con los integrones de bacterias presentes en el ambiente y de esta forma comprobar si el ambiente esta impactado con los desperdicios biomédicos de los hospitales. Los integrones son elemento de los genomas bacterianos con capacidad de capturar y expresar genes exógenos que confieren ventajas selectivas a la bacteria hospedadora (muchos de estos genes exógenos confieren resistencia a antibióticos). Esta investigación la estoy realizando con el Dr. Carlos Rodríguez, profesor de microbiología en UPR de Mayagüeeyeron colonias de algunas bacterias resistentz. En la investigación que estoy realizando es una continuación de su tesis doctoral, ya que este estuvo analizando los integrones ambientales de diferentes suelos. Esta área de la microbiología es muy interesante ya que puedo integrar mis conocimientos en la microbiología y en la medicina, además esto me ayuda a desenvolverme mejor en mi investigación. Durante el mes de enero estuve familiarizándome con las técnicas moleculares para el análisis de DNA. Entre estas PCR, lisado de células, corridas de gel y análisis de la misma. Para comenzar en el mes de febrero, a crear mi propia genoteca de clones de bacterias resistentes a antibióticos. Luego de identificar que las mismas poseen el fragmento de DNA de interés, extraerles el plásmido para llevarlas a secuenciar y poder compararlas con las secuencias de bacterias ambientales. Esta investigación se está realizando con la colaboración del hospital de veterano de San Juan, quienes nos proves a antibióticos que estos poseen.
